Blog

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) je tehnologija imunoeseja zasnovana na specifičnom vezivanju antigena i antitijela. Njegov osnovni princip je fiksiranje antigena ili antitijela specifične koncentracije na površinu polistirenske mikroploče fizičkom adsorpcijom, zatim dodavanje uzorka koji se testira i korištenje stupnja razvoja boje koji nastaje reakcijom između oznake enzima i supstrata. da indirektno odražava prisustvo ili odsustvo ili količinu antigena ili antitela koji se testira.

Kao vrsta tehnologije imunoobilježavanja (uključujući tehnologiju imunofluorescencije, imunoradiometrijsku tehnologiju, imunoenzimsku tehnologiju i tehnologiju imunokoloidnog zlata), ELISA tehnologija se široko koristi u naučnim istraživanjima i kliničkim eksperimentima zbog svojih karakteristika brze, osjetljive, kvalitativne ili kvantitativne detekcije.

ELISA je jedna od najčešće korištenih eksperimentalnih metoda u molekularnoj biologiji, imunologiji i istraživanju stanične biologije, ali u stvarnom radu ljudi se često susreću s raznim eksperimentalnim poteškoćama. Na primjer, u ELISA eksperimentima, veliko zatamnjenje je jedan od uobičajenih problema, koji ne samo da utječe na točnost eksperimentalnih rezultata, već može ometati i pouzdanost podataka. Zbog toga je posebno važno duboko razumjeti razloge za veliki blanking i poduzeti efikasne mjere optimizacije.

Visoko slijepo ispitivanje odnosi se na abnormalno povećanje vrijednosti apsorbancije negativne kontrole ili slijepe probe u ELISA eksperimentu. Normalno, vrijednost apsorbancije negativne jažice bi trebala biti manja od 0,1. Previsoka pozadinska vrijednost će ometati eksperimentalne rezultate, smanjiti točnost i pouzdanost podataka i onemogućiti preciznu procjenu pravog sadržaja antigena ili antitijela u uzorku.

Uobičajeni uzroci uključuju:

● Ploča nije čista

Rješenje:

▼Operite temeljno

Nedovoljno vrijeme pranja će uzrokovati ostatke antitijela, što će rezultirati obojenjem negativne kontrole.

Pokušajte produžiti vrijeme pranja, povećati broj pranja i dodati odgovarajuću količinu surfaktanta (kao što je Tween-20, 0,05%) u otopinu za pranje.

Prilikom pranja ploče u svakom koraku, vodite računa o tome da je pranje temeljno i dobro tapkajte po ploči sve dok ne bude vidljivih ostataka tečnosti u jamici.

▼Izbjegavajte unakrsnu kontaminaciju

Kada bacate otopinu za ispiranje ili inkubirate antitijela, pazite da izbjegnete unakrsnu kontaminaciju između jažica.

Vrhove pipete treba koristiti jednom što je više moguće kako bi se spriječila kontaminacija uzrokovana ponovnom upotrebom.

Filter papir koji se koristi prilikom tapkanja ploče ne treba ponovo koristiti kako bi se izbjegla sekundarna kontaminacija.

● Koncentracija antitela ili reagensa je previsoka

Razlog: Koncentracija antitijela, sekundarnog antitijela označenog enzimom ili kromogenog supstrata je previsoka, što rezultira povećanom nespecifičnom reakcijom i povećanim pozadinskim signalom.

Rješenje:

▼Optimizirajte koncentraciju antitijela: razrijedite antitijelo do odgovarajuće radne koncentracije kako biste izbjegli predoziranje.

▼Kontrolirajte koncentraciju reagensa: striktno prilagodite koncentraciju sekundarnog antitijela označenog enzimom i kromogenog supstrata kako biste spriječili prekomjernu koncentraciju.

▼Izvršite eksperiment s gradijentom razrjeđivanja: postepeno razblažite kroz preliminarne eksperimente kako biste odredili optimalnu koncentraciju svakog reagensa i smanjili smetnje u slijepome.

● Nepotpuno blokiranje

Razlog: otopina za blokiranje (kao što je BSA) može unakrsno reagirati s antitijelom, što rezultira povećanjem pozadinskog signala. Ako je koncentracija otopine za blokiranje preniska ili je vrijeme blokiranja prekratko, blokiranje možda neće biti potpuno, uzrokujući da se antitijelo nespecifično veže za ELISA ploču, čime se povećava pozadinska vrijednost.

Rješenje:

▼Koristite odgovarajući rastvor za blokiranje i podesite koncentraciju rastvora za blokiranje.

▼Vrijeme blokiranja treba biti dovoljno, obično 1-2 sata (sobna temperatura) ili preko noći na 4°C.

▼ Obavezno operite jažice ploče nakon blokiranja kako biste uklonili višak otopine za blokiranje.

●Reakcija boje je preduga

Razlog: Zbog nepravilne optimizacije sistema, reakcija boje uzorka je slaba. Kako bi se nadoknadio ovaj nedostatak, vrijeme reakcije boje se produžava. Dugo vrijeme reakcije boje dovodi do povećanja nespecifičnih reakcija supstrata.

Rješenje:

▼Sistem detekcije treba optimizirati, a koncentracije premaza, antitijela za detekciju i supstrata treba prilagoditi kako bi se osigurale osjetljive i specifične reakcije.

▼Skratite vrijeme reakcije u boji, obično ne više od 15 minuta, kako biste osigurali točnost eksperimentalnih rezultata i izbjegli smetnje u slijepome.

● Kontaminacija ili degradacija reagensom

Razlog: Može doći do kontaminacije tokom pripreme ili skladištenja reagensa i pufera, što dovodi do povećanog zatamnjenja.

Rješenje:

▼ Koristite svježe pripremljene reagense kako biste izbjegli unakrsnu kontaminaciju.

▼ Koristite filtrirane otopine kako biste osigurali čistoću reagensa.

▼ Provjerite datume isteka antitijela, supstrata, otopina za pranje i pufera kako biste izbjegli korištenje pokvarenih reagensa.

● Temperatura i faktori okoline

Razlog: Previsoka temperatura ili visoka vlažnost dovest će do pojačanih nespecifičnih reakcija, što će rezultirati povećanim zatamnjivanjem

Rješenje:

▼ Provjerite inkubator kako biste bili sigurni da je temperatura inkubacije stabilna na 37°C i inkubirajte prema vremenu reakcije u uputama.

▼ Izbjegavajte dugotrajno izlaganje udubljenja ploča visokim temperaturama ili jakom svjetlu.

Instrumenti i oprema su osnova za uspjeh ELISA eksperimenata. Često korištena srodna oprema uključuje pipete, čitače mikropločica, perače ploča i inkubatore. Sva oprema se mora redovno provjeravati i kalibrirati kako bi se osigurala tačnost i preciznost. Welso nudi visokokvalitetnu opremu potrebnu za različite ELISA eksperimente. Dobrodošli da nas kontaktirate za više informacija.