Blog

Ćelije sa trofoblastnom funkcijom nazivaju se trofoblasti, koji potiču iz trofoblasta izvan embrija i ključna su karika u normalnoj trudnoći. Nakon implantacije embrija, trofoblasti se dijele, multiplaziju i diferenciraju kako bi formirali EVCT i vilozne citotrofoblaste (VCT) s izrazito različitim biološkim karakteristikama.

Osnovni princip izolacije i kulture ljudskih viloznih ekstraviloznih trofoblasta je da EVCT ima sposobnost invazije, agregira se u dubokom dijelu decidua materice da formira otoke i da je u najbližem kontaktu sa ćelijama decidua materice, što je važan dio imunološkog mikrookruženja majke i fetusa.

Vilozno tkivo je odabrano iz decidua i filtrirano enzimskom digestijom, zatim mljevenjem i filtriranjem, te je izvršeno centrifugiranje u gradijentu gustine, a sloj gustine od 40% apsorbovan je prema gustini ćelija da bi se dobile ćelije trofoblasta, a EVCT je bio dalje pročišćena kratkotrajnom kulturom u različito vrijeme.

Prema morfologiji, fenotipu i funkcionalnim karakteristikama ćelija, ćelije su identifikovane, izolovane i pročišćene imunohistohemijom ili fluorescentnim antitelima koja su istovremeno označavala antigene na površini ćelije za sortiranje protočnom citometrijom, što čini temelj za dubinsku raspravu o biološkim funkcijama trofoblasta. .

Reagensi i instrumenti

reagens:

PBS rastvor, D-Hanks rastvor, RBC lizat

DMEM/F12 podloga za kulturu, fetalni goveđi serum, tripsin

Kolagenaza tip IV, Dnaza tip I, fibronektin (FN)

Kolagen tipa IV, Matrigel, Percoll osnovni rastvor, antibiotici

instrument:

Oftalmološke makaze, pincete, sita različitih veličina (80 mesh, 300 mesh)

Sve vrste petrijevih posuda, drške za špriceve, plastične epruvete za centrifugiranje različitih specifikacija

1,5 ml EP epruvete, pipete, Welso WLR600 stolna rashladna centrifuga niske brzine

Magnetni stubovi i kolone za sortiranje kuglica, CO2 inkubatori, šejkeri za vodeno kupatilo, protočni citometri

Eksperimentalni postupak

Osnovni koraci za izolaciju i kulturu ekstraviloznih trofoblasta ljudskih resica mogu se podijeliti u sljedeće korake:

1. Priprema reagensa

(1) Rastvor kolagena tipa IV: rastvorite kolagen tipa IV sa 0,25% glacijalne sirćetne kiseline i potpuno ga rastvorite na 4 °C preko noći, sa konačnom koncentracijom od 2,0 mg/ml. Prilikom upotrebe, ploča je pakirana na 6~10 μg/c㎡ i preko noći na 4 °C. Ploče sa ćelijskom kulturom obložene kolagenom tipa IV mogu se sterilisati preko noći UV zračenjem ili isprati sa 75% etanolom.

(2) FN rastvor: rastvoriti 1 mg FN suvog praha u 1 ml sterilne destilovane vode, ostaviti na sobnoj temperaturi 30 minuta da se prirodno rastvori i čuvati u koncentraciji od 1 mg/ml. Alikvot u 20 μl/epruveta i čuvati na -70 °C.

(3) Rastvorite 20 μl rastvora FN u 1 ml FD medijuma (koncentracija 20 μg/ml), sipajte u Petrijevu posudu prečnika 35 mm, inkubirajte na sobnoj temperaturi 45 minuta i bacite medijum.

Napomena:

Neposredno obložene Petrijeve zdjelice mogu se koristiti ili čuvati na -20 °C, ali ne duže od 2 sedmice.

2. Svježe decidualno tkivo je isprano tri puta sa 1x PBS da bi se uklonili krvni ugrušci i fetalne membrane, a dobijeno je i tkivo resica koje je oftalmološkim makazama izrezano na 1 mm 3 komade.

3. Dodajte 0,25% tripsina i 0,1% DNaze I, digestirajte u vodenom kupatilu na 37 °C uz lagano mućkanje 5 minuta, a zatim aspirirajte digestiju i bacite.

4. Preostalo tkivo je digestirano sa 0,25% tripsina i 0,1% DNaze I u vodenom kupatilu na 37 °C tokom 10 minuta, digestija je aspirirana i dodato je 10% telećeg seruma da se prekine varenje. Ponovite ovo 3-4 puta i sakupite sav supernatant.

5. Probavljeni supernatant bogat trofoblastima je filtriran kroz sito od 80 mesh i 300 mesh naizmjence, filtrirana tečnost je sakupljena, centrifugirana na 300 g 10 minuta, a supernatant je odbačen.

6. Ćelijske pelete su resuspendirane i postavljene na diskontinuirani Percoll gradijent (10%~70%, jedan gradijent na 10%) i centrifugirane na 1000 g 20 min.

7. Apsorbujte ćelije sa slojem gustine od 40% (p=1,048~1,062 g/ml) kao trofoblaste i dodajte DMEM medijum za kulturu sa visokim sadržajem glukoze koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma nakon ispiranja.

8. Podesite gustinu ćelija na 5x10/ml, posadite u prethodno obloženu ploču tipa IV kolagenom (ili FN ili Matrigel) i inkubirajte 10 minuta da biste uklonili fibroblaste koji se lako prianjaju. Inkubirajte u inkubatoru na 37 °C, 5% CO2 24 sata prije prve promjene podloge za kulturu.

9. Nakon 24 h, status rasta ćelija posmatran je pod invertovanim faznim kontrastnim mikroskopom. EVCT može migrirati i agregirati, ali se ne spaja, a proliferativna sposobnost je slaba.

10. Imunohistohemijska identifikacija dobijenih ćelija izvršena je na osnovu karakteristika vimentin negativnih, CK7 pozitivnih.

11. Nakon što je obeležen anti-HLA-G površinskim antitelom, FACSAriaII je sortirao i prečistio HLA-G+ ćelije ekstravilusa trofoblasta sa čistoćom >95%.

Napomena

●Vilozno tkivo se može probaviti sa 1 mg/ml kolagenaze IV i 0,1 mg/ml Dnaze I u zavisnosti od laboratorijskih uslova.

●EVCT ima slab proliferativni kapacitet, a previše pasaža može lako uzrokovati gubitak određenih bioloških karakteristika ćelija, pa je važno smanjiti broj pasaža u kultivisanim ćelijama.

●EVCT i VCT eksprimiraju CK7 i ne eksprimiraju vimentin, a mogu se identifikovati imunohistohemijom c-erbB-2 kako bi se napravila razlika između EVCT (pozitivan na c-erbB-2) i VCT (negativan za c-erbB-2).