Blog

Primarne ćelije su ćelije koje su direktno izolovane iz tkiva. Oni ne samo da održavaju morfologiju normalnih stanica, već i zadržavaju ključne biološke markere i funkcije u tijelu. U poređenju sa ćelijskim linijama, eksperimentalni podaci dobijeni od primarnih ćelija bliži su stvarnom fiziološkom okruženju, pa su od velike vrednosti u biomedicinskim istraživanjima.

Budući da su njihova biološka svojstva u osnovi nepromijenjena, primarne ćelije mogu preciznije simulirati karakteristike rasta tijela i našle su široku primjenu u molekularnoj biologiji, ćelijskoj biologiji i osnovnim biomedicinskim istraživanjima, kao što su proteomika, genomika, istraživanje stanica i genetička istraživanja. U isto vrijeme, oni su također idealni ćelijski modeli u području biofarmaceutika i široko se koriste u istraživanju mehanizama bolesti, skriningu lijekova, metabolizmu lijekova, toksikološkoj evaluaciji, istraživanju lijekova protiv raka i razvoju liječenja.

Ekstrakcija ćelija i kultura in vitro odnosi se na proces izolovanja ćelija iz tkiva ili organa i njihovog kultivisanja u odgovarajućim uslovima. Specifični koraci uključuju: dobivanje ciljnog tkiva u sterilnim uvjetima, korištenje probavnih enzima kao što su tripsin ili kolagenaza za razdvajanje tkiva u jednu ćelijsku suspenziju, zatim odvajanje ćelija centrifugiranjem, filtracijom, itd., i konačno njihovo kultiviranje u pogodnom okruženju kulture kako bi se održao njihov rast i funkcija.

U nastavku ćemo podijeliti specifične korake za primarnu izolaciju ćelija pomoću rashladne centrifuge male brzine:

Eksperimentalni koraci (metoda kulture probave)

Priprema i pranje tkiva

Uzmite oko 1 cm³ ciljnog tkiva u sterilnim uslovima, stavite ga u tanjir ili čašu i više puta isperite odgovarajućom količinom Hanks rastvora da biste uklonili ostatke krvi i vezivno tkivo.

Mljevenje tkiva i predtretman

Upotrijebite oštre makaze da usitnite tkivo na male komadiće približno 0,5 mm × 1 mm, ponovo isperite Hanksovom otopinom i bacite otopinu za pranje nakon što se komadići maramice slegnu.

Varenje enzima

Prenesite komadiće tkiva u konusnu čašu sa prethodno instaliranom sterilnom magnetnom mešalicom i dodajte 5-30 mL tripsina ili kolagenaze.

Čvrsto pokrijte gumenim čepom i zatvorite limenom folijom i stavite na magnetnu mješalicu u inkubator na 37°C.

Pokrenite mješalicu i ravnomjerno promiješajte. Koristite mikroskop da posmatrate disperziju ćelija tokom procesa varenja.

Kada se većina ćelija disocira u jedno stanje (oko 10-20 minuta), odmah dodajte odgovarajuću količinu Hanksovog rastvora da biste prekinuli varenje.

Filtracija ćelija

Prvo, filtrirajte s mrežicom od nehrđajućeg čelika od 100 μm kako biste uklonili neprobavljeno tkivo ili velike skupine stanica.

Zatim filtrirajte sa 20 μm mrežicom od nerđajućeg čelika da biste dobili relativno čistu jednoćelijsku suspenziju.

Centrifugiranje pri malim brzinama i pranje ćelija

Filtrat je prebačen u epruvetu za centrifugiranje i centrifugiran na 500×g (oko 5 minuta).

Supernatant je odbačen i ćelije su dva puta isprane Hanksovim rastvorom da bi se uklonili zaostali digestivni enzimi.

Ćelije su resuspendirane u mediju sa serumom i lagano protresene da bi se pripremila ćelijska suspenzija.

Brojanje ćelija i inokulacija

Koristite hemocitometar da prebrojite i odredite koncentraciju ćelijske suspenzije (obično 1×10⁵~3×10⁵ ćelija/mL).

Ravnomjerno inokulirajte ćelije u posudu za kulturu i uzgajajte u inkubatoru na 37°C, 5% CO₂.

Ova metoda može efikasno dobiti visoko održive primarne ćelije i obezbediti pouzdan model ćelije za naredne eksperimente. Upotreba rashladne centrifuge male brzine može pomoći u poboljšanju efikasnosti odvajanja primarnih ćelija, istovremeno osiguravajući vitalnost ćelija, dajući visokokvalitetne uzorke ćelija za naknadne eksperimente.

Bilješke

Ispiranje tkiva

Prije probave, blokove tkiva potrebno je isprati 2-3 puta kako bi se uklonili inhibitorni efekti jona kalcija, magnezija i seruma na tripsin i EDTA.

Hanksov rastvor ili drugi odgovarajući pufer se može koristiti za lagano protresanje ili miješanje blokova tkiva u otopini za ispiranje, a otopina za ispiranje se može baciti nakon što se ometajuće supstance potpuno uklone kako bi se osigurao učinak enzimske probave.

Uloga probavnih enzima

Tripsin je proteolitički enzim koji luči gušterača. Uglavnom djeluje na peptidne veze koje povezuju lizin i arginin, razgrađujući proteine u manje polipeptide i aminokiseline, što pomaže stanicama da se rasprše.

Kolagenaza je izvedena iz bakterija i ima snažnu sposobnost hidrolize kolagena. Može efikasno probaviti fibrozno tkivo, epitelno tkivo, pa čak i neka tkiva raka.

Poboljšajte stopu preživljavanja ćelija

Pravilno povećanje gustine sjetve ćelija primarne kulture može promovirati interakciju između stanica i učiniti ih bližim okruženju za rast in vivo, čime se poboljšava stopa preživljavanja ćelija i promovira adhezija i proliferacija.

Ključna uloga centrifuge u eksperimentima primarnog razdvajanja ćelija

U procesu primarne separacije ćelija, rashladna centrifuga male brzine igra vitalnu ulogu, uglavnom se koristi za obogaćivanje ćelija, uklanjanje probavnih enzima i ostataka i poboljšanje stope preživljavanja ćelija. Njegove ključne primjene u eksperimentima uključuju:

Obogaćivanje i sakupljanje ćelija

Nakon probave, tkivo će se razdvojiti u jednu ćelijsku suspenziju, ali se može pomiješati s nepotpuno probavljenim fragmentima tkiva, ostacima probavnih enzima i fragmentima stanica. Pravilnim postavljanjem rashlađene centrifuge niske brzine, netaknute ćelije se mogu efikasno istaložiti, enzimi i ostaci u supernatantu mogu biti uklonjeni i može se dobiti relativno čista suspenzija ćelija.

Isperite ćelije kako biste uklonili zaostale probavne enzime

Probavni enzimi kao što su tripsin i kolagenaza mogu utjecati na normalnu funkciju stanica ili čak biti toksični za stanice. Stoga, nakon prvog centrifugiranja, stanice treba resuspendirati u mediju bez seruma ili Hanksovom rastvoru i dvaput isprati, svaki put centrifugirati pri maloj brzini i supernatant odbaciti kako bi se osiguralo da se većina zaostalih enzima ukloni i da se poboljša stopa preživljavanja stanica.

Koncentracija ćelija i optimizacija uslova kulture

Prije inokulacije, ćelije se mogu dalje koncentrirati centrifugiranjem pri maloj brzini kako bi se povećala gustina inokulacije. Odgovarajuća gustina ćelija ne samo da olakšava interakciju između ćelije, već i promoviše adheziju i proliferaciju, čime se povećava stopa preživljavanja primarnih ćelija i stopa uspeha kulture.

Rashladne centrifuge male brzine ne samo da igraju ključnu ulogu u odvajanju primarnih ćelija, već se takođe široko koriste u mnogim poljima kao što su kultura ćelija, klinička medicina, biofarmaceutika, molekularna biologija i obrada krvi. Njegova mala brzina i efikasna kontrola temperature čine ga idealnim izborom za temperaturno osjetljivu obradu uzoraka. Kada se koristi centrifuga, parametri centrifugiranja i operativni postupci trebaju biti razumno optimizirani kako bi se poboljšala stopa uspjeha eksperimenta i osigurao integritet uzorka i stabilnost eksperimentalnih rezultata.