Blog

Čitač mikroploče je uobičajen laboratorijski instrument koji se široko koristi u mjerenju koncentracije proteina i drugim biohemijskim eksperimentima. Njegov princip se zasniva na metodi apsorpcije svetlosti, koja određuje koncentraciju ciljne supstance u uzorku merenjem apsorbancije svetlosti rastvora uzorka na određenoj talasnoj dužini. Kada se koristi čitač mikroploče, protein ili druge biohemijske supstance u uzorku obično reaguju sa određenim reagensom u boji kako bi se dobio proizvod sa specifičnim karakteristikama apsorpcije svetlosti. Instrument emituje svetlost određene talasne dužine, a nakon prolaska kroz uzorak detektor meri intenzitet propuštenog svetla.

Poređenjem apsorbancije sa standardnom krivom, koncentracija ciljne supstance u uzorku može se precizno izračunati. Standardna kriva se obično pravi od serije standardnih uzoraka poznatih koncentracija, a njena apsorpcija se koristi za kalibraciju čitača mikroploče kako bi se osigurala tačnost rezultata mjerenja. Visoka osjetljivost i visoka preciznost čitača mikropločica čine ga osnovnim alatom za biohemijske eksperimente kao što su mjerenje koncentracije proteina, analiza aktivnosti enzima i eksperimenti proliferacije stanica.

Protein je važan biomakromolekul u živim organizmima, a određivanje njegovog sadržaja je od velikog značaja u biološkim naučnim istraživanjima i biotehnološkoj industriji. Čitač mikroploče je precizan instrument koji se koristi za detekciju koncentracije biomolekula, koji kvantitativno analizira ciljne molekule na osnovu promjene boje uzrokovane reakcijama kataliziranim enzimima.

Welso je podijelio BCA metodu (kolorimetrijska metoda) za određivanje koncentracije proteina. Princip je da protein reaguje sa jonima bakra (Cu²⁺) u alkalnim uslovima da bi formirao ljubičasto-plavi kompleks. Kompleks ima karakterističan maksimum apsorpcije na određenoj talasnoj dužini (obično 562 nm), a njegova apsorpcija je linearno proporcionalna koncentraciji proteina u uzorku. Mjerenjem apsorbancije pomoću čitača enzima i poređenjem sa standardnom krivom, koncentracija proteina u uzorku može se precizno izračunati. Ova metoda se široko koristi za brzo određivanje koncentracije proteina zbog svoje visoke osjetljivosti i jednostavnog rada.

Eksperimentalna svrha 

Savladajte upotrebu čitača mikropločica i upoznajte se s procesom i funkcijama njegovog rada

Naučite osnovne principe i korake rada kvantitativne analize proteina.

Izmjerite koncentraciju proteina BCA metodom i provjerite tačnost eksperimentalnih rezultata.

Eksperimentalni materijali i instrumenti 

Materijali

Standardna otopina proteina (kao što je albumin goveđeg seruma)

Uzorak otopine proteina za testiranje

BCA rješenje

Mikroploča sa 96 jažica

Reagensi 

Bakar sulfat

Natrijum sulfat

Natrijum hidroksid, itd.

Instrumenti 

ELISA čitač

Elektronska ravnoteža

Pipetori

Termostatsko vodeno kupatilo

Eksperimentalni koraci 

●Podešavanje Standardnih krivulja

A. Pripremite BCA rastvor prema uputstvima za komplet.

B. Razrijedite standardnu otopinu proteina dejoniziranom vodom na različite gradijente koncentracije (kao što su 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 ug/mL)

C. Dodajte razblaženi standardni rastvor u svaku mikroploču sa 96 jažica, 100 μL po jažici.

D. Dodajte 100 μL BCA rastvora u svaku jažicu i dobro promešajte.

E. Stavite mikroploču u ELISA čitač i izmjerite vrijednost apsorbancije na talasnoj dužini od 562 nm

Postavite standardnu krivu s koncentracijom proteina kao horizontalnom osom i vrijednošću apsorpcije kao vertikalnom osom

●Određivanje uzorka

A. Razblažite uzorak proteina koji se testira dejonizovanom vodom do odgovarajuće koncentracije.

B. Dodajte razblažene uzorke u mikroploču sa 96 jažica, 100 μL u svaku jažicu.

C. Dodajte 100 μL otopine BCA u svaku jažicu i dobro promiješajte.

D. Stavite mikroploču u ELISA čitač i izmjerite vrijednost apsorbancije na talasnoj dužini od 562 nm.

●Analiza rezultata

Na osnovu vrijednosti apsorpcije izmjerenog uzorka, pronađite odgovarajući protein na standardnoj krivulji, a zatim izračunajte koncentraciju proteina u otopini uzorka na osnovu zapremine uzorka.

BCA metoda je najčešće korištena metoda kvantitativne analize proteina s prednostima jednostavnog rada, visoke osjetljivosti i jake specifičnosti. Tokom eksperimenta, posebnu pažnju treba posvetiti sprečavanju denaturacije, degradacije i kontaminacije proteina kako bi se osigurala tačnost rezultata. Rezultati ovog eksperimenta pokazuju da BCA metoda može efikasno odrediti koncentraciju uzoraka proteina i pružiti pouzdanu podršku podataka za kasnija istraživanja proteina.

Ovaj eksperiment je uspješno koristio ELISA instrument i BCA metodu za određivanje koncentracije uzoraka proteina, potvrdio je izvodljivost metode i pružio važnu referencu za kvantitativnu analizu proteina.