مدونات

في تجارب علم الأحياء الجزيئي وعلم الأحياء الخلوي، يعد الاستخلاص عالي النقاء للبروتينات النووية خطوة أساسية في دراسة العمليات النووية مثل تنظيم الجينات ونشاط عامل النسخ وبنية الكروماتين. ونظرًا للاختلاف في التوزيع بين البروتينات النووية والبروتينات السيتوبلازمية، ولضمان دقة البيانات التجريبية، يلزم وجود طريقة استخلاص بروتين نووي ذات تلوث متبادل منخفض وسهولة التشغيل للحصول على عينات بروتين نووي عالية النقاء. بالإضافة إلى ذلك، فإن البروتينات النووية حساسة للبيئة الخارجية، ويجب إيلاء اهتمام خاص لظروف التشغيل أثناء عملية الاستخلاص، مثل التحكم في درجة الحرارة واستخدام مثبطات البروتين، للحفاظ على نشاط البروتين وتجنب التحلل.

من المهم بشكل خاص اختيار طريقة استخراج البروتين النووي المناسبة للاحتياجات التجريبية المختلفة. على سبيل المثال، بالنسبة للبروتينات التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في النواة مثل HIF1-α وTWIST، يوصى باستخدام مجموعة استخراج البروتين النووي أو عازل تحلل البروتين النووي المخصص للاستخراج. لا تعمل هذه الطرق على تحسين خطوات التشغيل فحسب، بل تقلل أيضًا بشكل فعال من التلوث المتبادل بين السيتوبلازم والبروتينات النووية، مما يوفر أساس عينة موثوق به للتجارب اللاحقة (مثل Western Blot و immunopreceptication وما إلى ذلك).

فيما يلي طريقتان سهلتا الاستخدام نسبيًا لاستخراج البروتين النووي:

بالنسبة للبروتينات ذات التعبير العالي في النواة، مثل HIF1-α وTWIST، يجب استخدام مجموعة خاصة لاستخراج البروتين النووي أو عازل تحلل البروتين النووي للاستخراج.

خطوات استخراج البروتين النووي (طريقة طحن التجانس)

التحضير

قبل تجربة استخراج البروتين النووي، يجب تحضير الكواشف والعوازل ذات الصلة مسبقًا لضمان سير العملية التجريبية بسلاسة. فيما يلي الصيغة التفصيلية واستخدام محلول صبغة Trypan Blue والمحلول العازل:

صيغة محلول صبغة Trypan Blue

تحضير المحلول الأم: قم بوزن كمية مناسبة من مسحوق Trypan Blue وقم بتذويبها في 10 مل من الماء المقطر المزدوج لتحضير محلول أم Trypan Blue بنسبة 4% (وزن/حجم).

تخفيف المحلول العامل: استخدم عازل PBS لتخفيف المحلول الأم 10 مرات للحصول على محلول عامل بتركيز 0.4%.

الاستخدام: امزج محلول عامل 0.4% من التريبان الأزرق مع معلق الخلايا بنسبة 1:1 لحساب الخلايا أو الكشف عن نشاط الخلايا.

صيغة المحلول العازل A (محلول تحلل الخلايا)

المكونات:

10 ملي مولار من هيبس (درجة الحموضة 7.9، 4 درجات مئوية)

1.5 ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم

10 ملي مولار من كلوريد البوتاسيوم

0.5 ملي مولار من ديثيوثريتول (DTT)

إذا كنت بحاجة إلى منع تحلل بروتينات البلازما من التأثير على البروتينات النووية، يمكنك إضافة 1 ملي مولار من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF)

الوظيفة:

يستخدم لتحلل غشاء الخلية، وإطلاق نوى الخلايا، وضمان سلامة نواة الخلية.

صيغة المحلول العازل B (محلول عازل لاستخراج البروتين النووي)

المكونات:

20 ملي مولار هيبس (درجة الحموضة 7.9)

25% (حجم/حجم) جلسرين

0.42 ملي مولار كلوريد الصوديوم

1.5 ملي مولار كلوريد المغنيسيوم

0.2 ملي مولار EDTA (حمض إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك)

0.5 ملي مولار PMSF

0.5 ملي مولار DTT

الوظيفة:

تمزيق الغشاء النووي وإطلاق البروتينات النووية مع الحفاظ على استقرار البروتينات ونشاطها.

خطوات استخلاص البروتين النووي

جمع الخلايا

● هضم الخلايا من القارورة وجمعها في أنابيب دقيقة.

● قم بالطرد المركزي بسرعة 300 جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السائل العلوي.

● اغسل ترسب الخلايا 3 مرات بمحلول PBS للتأكد من إزالة الشوائب المتبقية.

التحضير لتحلل الخلايا

● بعد الطرد المركزي، تخلص من السائل العلوي. أضف 5 أضعاف حجم المخزن المؤقت A المبرد مسبقًا (على سبيل المثال، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت A لكل 20 ميكرولتر من ترسب الخلايا)، ثم استخدم ماصة لخلطه، وعلق الخلايا بالكامل.

● ضع تعليق الخلايا على الثلج لمدة 10 دقائق، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 300 جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.

تحرير النواة

● بعد الطرد المركزي، تخلص من السائل العلوي، وأضف 25 ضعف حجم المحلول المخزن المؤقت A المبرد مسبقًا مرة أخرى، واستخدم الماصة برفق لإعادة تعليق الخلايا.

● انقل معلق الخلايا إلى جهاز التجانس Dounce للتجانس.

مراقبة التجانس

● أثناء عملية التجانس، خذ كمية صغيرة من معلق الخلايا واخلطها بحجم مساوٍ من صبغة التريبان الأزرق 0.4%.

● لاحظ تمزق غشاء الخلية تحت المجهر:

● إذا كانت معظم الخلايا ملطخة باللون الأزرق، فهذا يعني أن غشاء الخلية قد تمزق، ويجب إيقاف التجانس.

● إذا لم يتمزق تمامًا، استمر في التجانس.

فصل نواة الخلية عن السيتوبلازم

● عندما تتمزق معظم الخلايا، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب Eppendorf وقم بالطرد المركزي بسرعة 25000 جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

نتائج الطرد المركزي:

●يحتوي السائل العلوي على مكونات سيتوبلازمية.

●الراسب هو نواة الخلية، التي تحتوي على البروتين النووي.

استخراج البروتين النووي

●اجمع الراسب بعد الطرد المركزي، وأضف حجمًا واحدًا من المخزن المؤقت B المبرد مسبقًا، وانفخ برفق لإعادة تعليق الراسب.

●انقل المعلق إلى مجانس الأنسجة النظيف وقم بتجانسه 30 مرة للتأكد من إطلاق البروتين النووي بالكامل.

إذابة البروتين واستخراجه

●انقل المعلق المتجانس إلى أنبوب Eppendorf واحضنه في هزاز منخفض السرعة على الثلج لمدة 45 دقيقة للتأكد من إذابة البروتين النووي بالكامل.

●قم بالطرد المركزي بسرعة 25000 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية وجمع السائل العلوي، وهو البروتين النووي المنقى.

خطوات استخلاص البروتين النووي (طريقة الطقم)

التحضير

تحضير الكاشف

●اضبط مجموعة استخلاص البروتين النووي على درجة حرارة الغرفة.

●أضف PMSF إلى كاشف استخلاص البروتين البلازمي وكاشف استخلاص البروتين النووي إلى تركيز نهائي 1 مليمول.

●إذا كانت العينة تحتوي على سيستين، أضف DTT إلى كلا الكاشفين إلى تركيز نهائي 0.5 مليمول.

جمع الخلايا وغسلها

●هضم الخلايا من جدار القارورة وجمعها في أنبوب إيبندورف.

●قم بالطرد المركزي بسرعة 300 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السائل العلوي.

●اغسل الخلايا مرة أو مرتين بمحلول PBS لإزالة الشوائب المتبقية.

انحلال الخلايا

●قم بالطرد المركزي بسرعة 300 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السائل العلوي.

● أضف 5 أحجام من كاشف استخلاص بروتين البلازما (على سبيل المثال، أضف 100 ميكرولتر لكل 20 ميكرولتر من حبيبات الخلايا) واخلط برفق عن طريق الانعكاس للتأكد من تعليق الخلايا بالتساوي. كن حذرًا لتجنب الدوامات لمنع تمزق الخلايا المفرط.

تفاعل التحلل

● ضع تعليق الخلايا على الثلج لمدة 20 دقيقة لتحلل الخلايا تمامًا.

فصل البروتين السيتوبلازمي

● قم بالطرد المركزي بسرعة 250 جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتخلص من السائل العلوي.

● أضف حجمين من كاشف استخلاص بروتين البلازما المبرد مسبقًا إلى حبيبات الخلايا واخلط برفق.

إطلاق النواة

● استخدم حقنة بإبرة 0.14 مم لنفخها برفق 5 مرات لتحلل حبيبات الخلايا تمامًا.

● قم بالطرد المركزي بسرعة 10000 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية، ثم اجمع السائل العلوي (البروتين السيتوبلازمي) وتخلص من الكريات (البروتين النووي).

استخراج البروتين النووي

● أضف 50-100 ميكرولتر من كاشف استخراج البروتين النووي إلى راسب البروتين النووي، ثم انفخ برفق 5 مرات باستخدام محقنة إبرة بقطر 0.14 مم للتأكد من تعليق الراسب بالكامل.

● ضع المعلق على هزاز منخفض السرعة على الثلج واحتضنه لمدة 45 دقيقة لتعزيز إذابة البروتين النووي.

فصل البروتين النووي

● قم بالطرد المركزي بسرعة 16000 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية واجمع السائل العلوي، وهو بروتين النواة الخلوي المستخرج.

خطوات استخلاص بروتين النواة النسيجية

تحضير عينة الأنسجة

●وزن عينة الأنسجة المراد استخلاصها.

●قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة قدر الإمكان لزيادة كفاءة التجانس.

تجانس الأنسجة

●أضف 300-500 ميكرولتر من PBS لكل 50 مجم من الأنسجة.

●استخدم جهاز التجانس لتجانس الأنسجة بالكامل في ظل ظروف حمام الثلج لضمان تفكك الأنسجة تمامًا وتكوين معلق موحد.

الطرد المركزي وجمع الرواسب

●قم بالطرد المركزي بسرعة 500 جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من السائل العلوي في معلق الأنسجة.

●اجمع الرواسب التي تحتوي على خلايا وعضيات.

استخلاص نواة الخلية

●أضف الرواسب المجمعة إلى 200 ميكرولتر من محلول استخلاص بروتين البلازما.

●استمر في استخلاص بروتين النواة الخلوية وفقًا لخطوات الطرد المركزي المذكورة أعلاه.

يجب تحديد اختيار الطريقة المناسبة بناءً على الأهداف التجريبية وحجم العينة والمعدات التجريبية. في التطبيقات العملية، يمكن للباحثين اختيار طريقة استخراج البروتين النووي المناسبة بمرونة بناءً على احتياجاتهم الخاصة والخصائص المحددة للعينة. بغض النظر عن الطريقة التي يجب اختيارها، فإن ضمان دقة التشغيل وظروف درجات الحرارة المنخفضة هو المفتاح للحصول على بروتينات نووية عالية الجودة.

آمل أن توفر هذه المقالة مراجع قيمة للجميع، وتساعد في تحسين عملية استخلاص البروتين النووي، وتحسين موثوقية التجربة وإمكانية تكرارها.