مدونات

في مجال علم الأعصاب، تعد دراسة وظائف الخلايا البطانية الدماغية والدقيقة أمرًا بالغ الأهمية لفهم العمليات الفسيولوجية الطبيعية للدماغ وآليات تطور المرض. وقد تم استخدام تقنية استخراج الخلايا البطانية الدماغية الدقيقة الأولية على نطاق واسع، وذلك بشكل أساسي من خلال الحصول على هذه الخلايا من نماذج حيوانية، لاستكشاف بنية الخلايا البطانية ووظيفتها وتفاعلاتها بشكل عميق. توفر هذه التقنية مرجعًا مهمًا لدراسة مسببات الأمراض ذات الصلة وتطوير الأدوية العلاجية المستهدفة، وتعزز التقدم العلمي في مجال أمراض الأوعية الدموية الدماغية والأمراض العصبية التنكسية.

قام ويلسو بعناية بتجميع بروتوكول تجريبي لفصل واستخراج الخلايا البطانية الدقيقة للأوعية الدموية في المخ (BMECs) باستخدام جهاز طرد مركزي منخفض السرعة. تهدف المقالة إلى تزويد العاملين في المختبر بدليل فني موجز وسهل الفهم، مع تقديم الخطوات والاحتياطات الرئيسية للتجربة بالتفصيل، ومساعدة الباحثين العلميين على إتقان النقاط الرئيسية للعملية بسرعة. نأمل أنه من خلال هذه المشاركة، يمكننا تقديم إرشادات عملية ودعم للبحث في المجالات ذات الصلة وتسريع تقدم أبحاث الأوعية الدموية الدماغية وعلم الأعصاب.

مقدمة عن BMECs

الخلايا البطانية الدقيقة الأولية في الدماغ (BMECs) هي نوع مهم من الخلايا المعزولة والمزروعة والموسعة من أنسجة الدماغ. وهي موزعة بشكل أساسي في جدران الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ وتشكل المكون الأساسي للحاجز الدموي الدماغي. تلعب الخلايا البطانية الدقيقة الأولية في الدماغ دورًا حيويًا في تنظيم تبادل المواد عبر الحاجز الدموي الدماغي، والحفاظ على استقرار البيئة الداخلية للدماغ، والدفاع ضد غزو المواد الضارة من العالم الخارجي. وهي نموذج خلوي مهم لدراسة وظائف الأوعية الدموية الدماغية وآليات المرض.

المواد التجريبية

الحيوانات التجريبية: فئران SD (4-6 أسابيع من العمر، ذكر)

الأدوات والمواد الاستهلاكية: مقص جراحي كبير، ملقط، أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل، صفائح ذات 6 آبار

الكواشف والمحاليل: 75% إيثانول، محلول ملحي، كولاجيناز، 25% BSA، بولي ليسين

وسط الثقافة: وسط ثقافة أساسي DMEM/F12، وسط ثقافة كامل DMEM/F12

أدوات المختبر

منضدة فائقة النظافة: للعمل المعقم

جهاز طرد مركزي منخفض السرعة: لفصل الخلايا

حاضنة ثاني أكسيد الكربون: توفر بيئة مناسبة لزراعة الخلايا

الإجراءات التجريبية

التعامل مع الحيوانات التجريبية

●بعد تخدير الفئران، يتم نقعها في إيثانول بنسبة 75% لمدة دقيقة تقريبًا لتطهير السطح.

الحصول على المخ

●قطع الجلد على الرأس، وإزالة المخ بسرعة وبشكل كامل، ووضعه في وسط زراعة قاعدي مبرد مسبقًا من نوع DMEM/F12.

تنظيف الأنسجة

● في مقعد نظيف، قم بإزالة الجلطات الدموية الخارجية والسحايا والأوعية الدموية الخارجية للدماغ (قم بإجراء العملية في طبق).

● قم بإزالة المادة البيضاء (البنية السائبة) واحتفظ بالمادة الرمادية (أجزاء الدماغ اليمنى واليسرى على شكل صدفة).

الغسيل

●اغسل أنسجة المخ بشكل متكرر باستخدام وسط ثقافي مبرد مسبقًا عند 4 درجات مئوية لإزالة الشوائب.

القطع والمعالجة الأولية

●قطع أنسجة المخ إلى قطع صغيرة بحجم حوالي 1 مم³ ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.

●قم بفرم الأنسجة بشكل أكبر واستخدم الماصة برفق لتوزيع قطع الأنسجة.

الطرد المركزي

● قم بالطرد المركزي بسرعة 900 دورة في الدقيقة لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من السائل العلوي. أضف 5 مل من وسط DMEM/F12 الخالي من المصل واخلط جيدًا باستخدام ماصة.

● أضف 10 مل من الوسط و100 ميكرولتر من الكولاجيناز II وقم بالهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة.

قم بإعداد طبق مكون من 6 آبار

●في نفس الوقت، استخدم 1 مل من بولي ليسين لتغطية الطبق المكون من 6 آبار وقم بحضنه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

معالجة ما بعد الهضم

●بعد الهضم، أضف الوسط لتحييده، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 900 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتخلص من السائل العلوي.

●أضف 15 مل من محلول BSA بنسبة 25% وقم بالطرد المركزي بسرعة 2000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

استخراج الخلايا المستهدفة

● بعد الطرد المركزي، يمكن رؤية التقسيم الطبقي: الرواسب الحمراء الداكنة في الطبقة السفلية هي خلايا الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ.

● اشطف بولي-إل-ليسين برفق في الصفيحة ذات الستة آبار بالمحلول الملحي وكرر الغسيل مرتين.

إعادة تعليق الخلايا وزراعتها

● قم بإزالة الرواسب الدقيقة للأوعية الدماغية السفلية، وأضف المحلول الملحي الفسيولوجي واخلط جيدًا، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 900 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

● أعد تعليق الخلايا باستخدام وسط DMEM/F12 كامل طازج، ثم انقلها إلى صفيحة مطلية مكونة من 6 آبار، ثم قم بزراعتها في حاضنة.

من خلال هذا الإجراء التجريبي، نجحنا في استخراج وفصل الخلايا البطانية الدقيقة في دماغ الفئران، مما يوفر أساسًا تجريبيًا قويًا لمزيد من البحث. طوال العملية، تعد أجهزة الطرد المركزي منخفضة السرعة أداة رئيسية تساعدنا على فصل الخلايا وتنقية مجموعة الخلايا المستهدفة بكفاءة. ولضمان دقة وسلامة التجربة، جمعت ويلسو بعض نقاط تشغيل أجهزة الطرد المركزي منخفضة السرعة للرجوع إليها من قبل المشغلين.

فحص المعدات ووضعها

● تأكد من وضع جهاز الطرد المركزي بشكل ثابت على طاولة صلبة لتجنب عدم الاستقرار الناتج عن الاهتزاز أو الميل.

● افحص المعدات قبل الاستخدام، وركز على فحص الدوار والأختام للتأكد من عدم وجود أي ضرر أو ارتخاء.

حماية التشغيل

● ارتدِ نظارات واقية وقفازات معملية أثناء التشغيل لمنع تناثر السوائل وتسببها في تلف الجلد والعينين.

السرعة والحمل

● انتبه إلى الحد الأقصى للسرعة والحد الأقصى للحمل للمعدات، ولا تتجاوز نطاق حمل جهاز الطرد المركزي.

● حدد سرعة الطرد المركزي والوقت المناسبين وفقًا للمتطلبات التجريبية. يجب ضبط السرعة والوقت وفقًا لكثافة العينة وغرض الفصل والحجم لتجنب التأثير على تأثير الفصل بسبب إعدادات المعلمات غير المناسبة.

إعداد العينة وتحميلها

● قبل دخول العينة إلى جهاز الطرد المركزي، تأكد من موازنة أنبوب الطرد المركزي والغطاء والدلو والمحول بدقة على الميزان، وأن تحمل الوزن لا يزيد عمومًا عن 1 جرام، وأن متطلبات الدقة لا تزيد عن 0.1 جرام، وأنها تلبي متطلبات دليل المعدات.

● يجب أن تكون المواد المعبأة في أنبوب الطرد المركزي ذات كثافة مماثلة لتجنب الاهتزاز الناتج عن توزيع الحمل غير المتساوي.

● يجب ألا تتجاوز سعة العينة الحد الأقصى لسعة أنبوب الطرد المركزي أو الدوار لمنع عدم توازن المعدات أو تلفها.

● يجب وضع العينة بشكل متماثل في الدوار لضمان توزيع قوة الطرد المركزي بالتساوي.

المواصفات التشغيلية

●يُحظر فتح أو إغلاق الغطاء أثناء تشغيل جهاز الطرد المركزي لتجنب الإصابات العرضية.

●بعد الطرد المركزي، تأكد من توقف الدوار تمامًا قبل فتح الغطاء. عند إخراج العينة، احرص على تجنب ملامسة أنبوب العينة عالي الحرارة أو تناثر السائل.

التنظيف والصيانة

●بعد الاستخدام، قم بتنظيف المعدات والدوار في الوقت المناسب للحفاظ على نظافة المعدات وتجنب التلوث أو التآكل.

●تحقق بانتظام من حالة تشغيل أجهزة الطرد المركزي لضمان استقرار المعدات وموثوقيتها على المدى الطويل.

●من خلال اتباع الاحتياطات المذكورة أعلاه، يمكنك ضمان سلامة العمليات التجريبية وإطالة عمر المعدات.

تعتبر أجهزة الطرد المركزي ضرورية في العديد من تجارب فصل الخلايا واستخراجها. إن الالتزام الصارم بمواصفات تشغيل أجهزة الطرد المركزي لا يضمن سلامة التجربة فحسب، بل ويطيل أيضًا عمر خدمة المعدات ويضمن موثوقية النتائج التجريبية. شركة Welso هي مورد محترف لأجهزة الطرد المركزي. يمكنك معرفة المزيد حول الميزات التفصيلية والمعايير الفنية لأجهزة الطرد المركزي منخفضة السرعة من خلال صفحة المنتج الخاصة بنا. كما نرحب بك للتواصل معنا في أي وقت للحصول على عرض الأسعار الأكثر ملاءمة.