مدونات

ELISA (اختبار الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم) هو تقنية اختبار مناعي تعتمد على الارتباط النوعي بين المستضد والأجسام المضادة. ومبدأها الأساسي هو تثبيت المستضد أو الجسم المضاد بتركيز معين على سطح صفيحة البوليسترين الدقيقة عن طريق الامتصاص الفيزيائي، ثم إضافة العينة المراد اختبارها، واستخدام درجة تطور اللون الناتجة عن التفاعل بين ملصق الإنزيم والركيزة لتعكس بشكل غير مباشر وجود أو غياب أو كمية المستضد أو الجسم المضاد الذي يتم اختباره.

باعتبارها نوعًا من تكنولوجيا وضع العلامات المناعية (بما في ذلك تكنولوجيا المناعة الفلورية، وتكنولوجيا المناعة الإشعاعية، وتكنولوجيا المناعة الإنزيمية، وتكنولوجيا الذهب المناعي الغرواني)، تم استخدام تكنولوجيا ELISA على نطاق واسع في البحث العلمي والتجارب السريرية بسبب خصائصها المتمثلة في الكشف السريع والحساس والنوعي أو الكمي.

إن ELISA هي واحدة من الطرق التجريبية المستخدمة بشكل شائع في أبحاث علم الأحياء الجزيئي وعلم المناعة وعلم الأحياء الخلوية، ولكن في التشغيل الفعلي، غالبًا ما يواجه الأشخاص صعوبات تجريبية مختلفة. على سبيل المثال، في تجارب ELISA، يعد التعتيم العالي أحد المشكلات الشائعة، والتي لا تؤثر فقط على دقة النتائج التجريبية، بل قد تتداخل أيضًا مع موثوقية البيانات. لذلك، من المهم بشكل خاص فهم أسباب التعتيم العالي بشكل عميق واتخاذ تدابير تحسين فعالة.

يشير التعتيم العالي إلى زيادة غير طبيعية في قيمة الامتصاص للعينة السلبية أو العينة الفارغة في تجربة ELISA. عادةً، يجب أن تكون قيمة الامتصاص للعينة السلبية أقل من 0.1. ستتداخل قيمة الخلفية المرتفعة للغاية مع النتائج التجريبية، وتقلل من دقة وموثوقية البيانات، وتجعل من المستحيل تقييم المحتوى الحقيقي للمستضد أو الجسم المضاد في العينة بدقة.

تشمل الأسباب الشائعة ما يلي:

● اللوحة ليست نظيفة

الحل:

▼اغسل جيدًا

سيؤدي عدم كفاية وقت الغسيل إلى تكون بقايا الأجسام المضادة، مما يؤدي إلى تلون عنصر التحكم السلبي.

حاول إطالة وقت الغسيل وزيادة عدد مرات الغسيل وإضافة كمية مناسبة من المادة الخافضة للتوتر السطحي (مثل Tween-20، 0.05%) إلى محلول الغسيل.

عند غسل اللوحة في كل خطوة، تأكد من أن الغسيل شامل واضرب اللوحة جيدًا حتى لا يوجد سائل متبقي واضح في البئر.

▼تجنب التلوث المتبادل

عند التخلص من محلول الغسيل أو حاضنة الأجسام المضادة، احرص على تجنب التلوث المتبادل بين الآبار.

يجب استخدام أطراف الماصة مرة واحدة قدر الإمكان لمنع التلوث الناتج عن الاستخدام المتكرر.

لا ينبغي إعادة استخدام ورق الترشيح المستخدم عند النقر على اللوحة لتجنب التلوث الثانوي.

● تركيز الأجسام المضادة أو الكواشف مرتفع للغاية

السبب: تركيز الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالإنزيم أو الركيزة الكروموجينية مرتفع للغاية، مما يؤدي إلى زيادة التفاعل غير النوعي وزيادة الإشارة الخلفية.

الحل:

▼تحسين تركيز الأجسام المضادة: قم بتخفيف الأجسام المضادة إلى تركيز عمل مناسب لتجنب الجرعة الزائدة.

▼التحكم في تركيز الكاشف: قم بضبط تركيز الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالإنزيم والركيزة الكروموجينية بشكل صارم لمنع التركيز المفرط.

▼إجراء تجربة التخفيف التدريجي: قم بالتخفيف تدريجيًا من خلال التجارب الأولية لتحديد التركيز الأمثل لكل كاشف وتقليل تداخل التعتيم.

● حجب غير كامل

السبب: قد يتفاعل محلول الحجب (مثل BSA) مع الجسم المضاد، مما يؤدي إلى زيادة في إشارة الخلفية. إذا كان تركيز محلول الحجب منخفضًا جدًا أو كان وقت الحجب قصيرًا جدًا، فقد لا يكون الحجب كاملاً، مما يتسبب في ارتباط الجسم المضاد بشكل غير محدد بلوحة ELISA، وبالتالي زيادة قيمة الخلفية.

الحل:

▼استخدم محلول حجب مناسبًا واضبط تركيز محلول الحجب.

▼يجب أن يكون وقت الحجب كافيًا، وعادةً ما يكون من ساعة إلى ساعتين (في درجة حرارة الغرفة) أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

▼تأكد من غسل آبار اللوحة بعد الحجب لإزالة محلول الحجب الزائد.

●مدة تفاعل اللون طويلة جدًا

السبب: بسبب عدم تحسين النظام بشكل صحيح، يكون تفاعل لون العينة ضعيفًا. ولتعويض هذا النقص، يتم تمديد وقت تفاعل اللون. يؤدي وقت تفاعل اللون الطويل إلى زيادة التفاعلات غير النوعية للركيزة.

الحل:

▼يجب تحسين نظام الكشف، وضبط تركيزات الطلاء والأجسام المضادة للكشف والركيزة لضمان تفاعلات حساسة ومحددة.

▼تقصير وقت تفاعل اللون، بحيث لا يتجاوز عمومًا 15 دقيقة، لضمان دقة النتائج التجريبية وتجنب تداخل التعتيم.

● تلوث أو تدهور الكواشف

السبب: قد يحدث التلوث أثناء تحضير أو تخزين الكواشف والمحاليل، مما يؤدي إلى زيادة التعتيم.

الحل:

▼ استخدم الكواشف المحضرة حديثًا لتجنب التلوث المتبادل.

▼ استخدم المحاليل المفلترة لضمان نقاء الكواشف.

▼ تحقق من تواريخ انتهاء صلاحية الأجسام المضادة والركائز ومحاليل الغسيل والمحاليل العازلة لتجنب استخدام الكواشف المتدهورة.

● درجة الحرارة والعوامل البيئية

السبب: ارتفاع درجة الحرارة أو الرطوبة بشكل مفرط يؤدي إلى زيادة التفاعلات غير النوعية، مما يؤدي إلى زيادة التعتيم

الحل:

▼ افحص الحاضنة للتأكد من أن درجة حرارة الحضانة مستقرة عند 37 درجة مئوية وقم بالحضانة وفقًا لوقت التفاعل الموضح في التعليمات.

▼ تجنب تعريض آبار اللوحة لدرجات حرارة عالية أو ضوء قوي لفترة طويلة.

تشكل الأدوات والمعدات الأساس لنجاح تجارب ELISA. وتشمل المعدات ذات الصلة المستخدمة بشكل شائع الماصات وقارئات الصفائح الدقيقة وغسالات الصفائح والحاضنات. ويجب فحص جميع المعدات ومعايرتها بانتظام لضمان الدقة والضبط. توفر شركة Welso معدات عالية الجودة مطلوبة لتجارب ELISA المختلفة. نرحب بك للتواصل معنا لمزيد من المعلومات.