مدونات

تُسمى الخلايا ذات الوظيفة الغاذية بالخلايا الغاذية، والتي تنشأ من الخلايا الغاذية خارج الجنين وتشكل حلقة وصل رئيسية في الحمل الطبيعي. بعد زرع الجنين، تنقسم الخلايا الغاذية وتتكاثر وتتمايز لتكوين الخلايا الغاذية خارج الخلية والخلايا الغاذية الزغابية ذات الخصائص البيولوجية المختلفة بشكل واضح.

المبدأ الأساسي لعزل وزراعة الخلايا المغذية خارج الزغابات البشرية هو أن الخلايا المغذية خارج الزغابات لديها القدرة على الغزو والتجمع في الجزء العميق من بطانة الرحم لتشكيل الجزر، وتكون على اتصال وثيق بخلايا بطانة الرحم، وهو جزء مهم من البيئة المناعية للأم والجنين.

تم اختيار الأنسجة الزغاباتية من السائل الساقط وتصفيتها عن طريق الهضم الأنزيمي، ثم الطحن والترشيح، وتم إجراء الطرد المركزي لتدرج الكثافة، وتم امتصاص طبقة الكثافة 40٪ وفقًا لكثافة الخلايا للحصول على خلايا الأرومة الغاذية، وتم تنقية EVCT بشكل أكبر عن طريق الثقافة قصيرة الأمد في أوقات مختلفة.

وفقًا لشكل الخلايا ونمطها الظاهري وخصائصها الوظيفية، تم تحديد الخلايا وعزلها وتنقيتها بواسطة المناعة الكيميائية أو الأجسام المضادة الفلورية التي قامت في نفس الوقت بوضع علامات على مستضدات سطح الخلية من أجل فرز التدفق الخلوي، مما يشكل أساسًا لمناقشة متعمقة للوظائف البيولوجية للخلايا المغذية.

الكواشف والأجهزة

الكاشف:

محلول PBS، محلول D-Hanks، محلول RBC، وسط زراعة DMEM/F12، مصل الجنين البقري، التربسين

كولاجيناز النوع الرابع، DNase النوع الأول، فيبرونيكتين (FN)

كولاجيناز النوع الرابع، Matrigel، محلول مخزون Percoll، المضادات الحيوية

أداة:

مقصات العيون، ملاقط، شاشات بأحجام مختلفة (80 شبكة، 300 شبكة)

جميع أنواع أطباق بتري، مقابض الحقن، أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية بمواصفات مختلفة

أنابيب EP سعة 1.5 مل، ماصات، أجهزة الطرد المركزي المبردة منخفضة السرعة من طراز Welso WLR600

أعمدة فرز الأقطاب المغناطيسية والخرز، حاضنات ثاني أكسيد الكربون، هزازات حمام الماء، أجهزة قياس التدفق الخلوي

الإجراء التجريبي

يمكن تقسيم الخطوات الأساسية لعزل وزراعة الخلايا المغذية الزغيبية البشرية خارج الزغيبات إلى الخطوات التالية:

1. تحضير الكواشف

(1) محلول الكولاجين من النوع الرابع: قم بإذابة الكولاجين من النوع الرابع مع 0.25% من حمض الأسيتيك الجليدي، ثم قم بإذابته بالكامل عند 4 درجات مئوية طوال الليل، مع تركيز نهائي 2.0 مجم/مل. عند الاستخدام، تم تعبئة اللوحة عند 6~10 ميكروجرام/سم2 وطوال الليل عند 4 درجات مئوية. يمكن تعقيم ألواح زراعة الخلايا المطلية بالكولاجين من النوع الرابع طوال الليل باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو شطفها بإيثانول بنسبة 75%.

(2) محلول FN: قم بإذابة 1 ملغ من مسحوق FN الجاف في 1 مل من الماء المقطر المعقم، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ليذوب بشكل طبيعي، وقم بتخزينه بتركيز 1 ملغ/مل. قسمه إلى 20 ميكرولتر/أنبوب وقم بتخزينه عند درجة حرارة -70 درجة مئوية.

(3) قم بإذابة 20 ميكرولتر من محلول FN في 1 مل من وسط FD (تركيز 20 ميكروجرام / مل)، ثم صبه في طبق بتري بقطر 35 مم، واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة، وتخلص من الوسط.

ملحوظة:

يمكن استخدام أطباق بتري المغلفة على الفور أو تخزينها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ولكن ليس أكثر من أسبوعين.

2. تم غسل الأنسجة اللزجة الطازجة ثلاث مرات بـ 1x PBS لإزالة جلطات الدم والأغشية الجنينية، وتم الحصول على أنسجة الزغابات وقطعها إلى 3 قطع بقطر 1 مم باستخدام مقص العيون.

3. أضف 0.25% تريبسين و0.1% DNase I، ثم قم بالهضم في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع رج لطيف لمدة 5 دقائق، ثم قم بشفط المهضوم وتخلص منه.

4. تم هضم الأنسجة المتبقية باستخدام 0.25% من التربسين و0.1% من DNase I في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتم شفط الهضم، وتم إضافة 10% من مصل العجل لإنهاء الهضم. كرر ذلك من 3 إلى 4 مرات، وجمع كل العصارة العلوية.

5. تم ترشيح السائل المهضوم الغني بالخلايا المغذية من خلال منخل 80 شبكة و300 شبكة على التوالي، وتم جمع السائل المفلتر، وتم طرده بسرعة 300 جم لمدة 10 دقائق، وتم التخلص من السائل المهضوم.

6. تم إعادة تعليق حبيبات الخلايا ووضعها على منحدر بيركول غير متصل (10٪ ~ 70٪، منحدر واحد لكل 10٪)، وتم طردها بسرعة 1000 جم لمدة 20 دقيقة.

7. امتصاص الخلايا ذات طبقة كثافة 40٪ (ص = 1.048 ~ 1.062 جم / مل) على شكل خلايا مغذية، وإضافة وسط ثقافة الجلوكوز العالي DMEM المحتوي على 10٪ من مصل الجنين البقري بعد الغسيل.

8. اضبط كثافة الخلايا إلى 5x10/مل، ثم زرعها في صفيحة مطلية مسبقًا بالكولاجين من النوع الرابع (أو FN أو Matrigel)، واحتضنها لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا الليفية التي تلتصق بسهولة. احتضنها في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة قبل تغيير وسط الثقافة لأول مرة.

9. بعد مرور 24 ساعة، تم ملاحظة حالة نمو الخلايا تحت المجهر التبايني الطوري المقلوب. يمكن لخلايا EVCT أن تهاجر وتتجمع، لكنها لا تندمج، والقدرة التكاثرية ضعيفة.

10. تم إجراء التعرف المناعي الكيميائي للخلايا التي تم الحصول عليها بناءً على خصائص الفيمنتين السلبية، CK7 الإيجابية.

11. بعد وضع علامة عليها باستخدام الأجسام المضادة السطحية لـ HLA-G، قامت FACSAriaII بفرز وتنقية خلايا الأرومة الغاذية خارج الزغابات HLA-G+ بنقاء يزيد عن 95%.

ملحوظة

●يمكن هضم الأنسجة الزغاباتية باستخدام 1 ملغ/مل كولاجيناز IV و 0.1 ملغ/مل DNase I اعتمادًا على ظروف المختبر.

●تتمتع تقنية EVCT بقدرة تكاثرية ضعيفة، وقد يؤدي المرور الكثير منها بسهولة إلى فقدان بعض الخصائص البيولوجية للخلايا، لذلك من المهم تقليل عدد المرور في الخلايا المزروعة.

●يعبر كل من EVCT وVCT عن CK7 ولا يعبران عن الفيمنتين، ويمكن التعرف عليهما من خلال المناعة النسيجية لـ c-erbB-2 للتمييز بين EVCT (إيجابي لـ c-erbB-2) وVCT (سلبي لـ c-erbB-2).